Diagnosen av botulisme er basert på identifisering av Clostridium botulinumtoksin i laboratoriet og på observasjon av kliniske symptomer, selv om de noen ganger ikke er spesifikke. Sykdommen kan faktisk forveksles med Guillain-Barré syndrom, poliomyelitt, hjerneslag, myasthenia gravis og tick-lammelse.
I mat botulisme er bildet av nevromuskulære lidelser og inntak av potensielt forurenset mat viktige ledetråder. Samtidig manifestasjon i minst 2 pasienter som spiste samme mat forenkler diagnosen. Bekreftelsen oppnås ved å isolere mikroorganismen med dyrkningstesten av mistenkte matprøver eller avføring fra pasienten og med identifisering av botulinumtoksin i mat eller biologiske materialer (som blod, magesaft og oppkast).
I sårbotulisme bekrefter diagnosen serumtoksin eller isoleringen av Clostridium botulinum fra en hudlesjonsprøve dette.
